HIGH SENSITIVE PCR METHOD FOR DETECTION OF PATHOGENIC Leptospira spp. IN PARAFFIN-EMBEDDED TISSUES / PCR altamente sensible para la detección de Leptospira spp. patógenas en tejidos embebidos en parafina

This study describes the development and application of a new PCR assay for the specific detection of pathogenic leptospires and its comparison with a previously reported PCR protocol. New primers were designed for PCR optimization and evaluation in artificially-infected paraffin-embedded tissues. PCR was then applied to post-mortem, paraffin-embedded samples, followed by amplicon sequencing. The PCR was more efficient than the reported protocol, allowing the amplification of expected DNA fragment from the artificially infected samples and from 44% of the post-mortem samples. The sequences of PCR amplicons from different patients showed >99% homology with pathogenic leptospires DNA sequences. The applicability of a highly sensitive and specific tool to screen histological specimens for the detection of pathogenic Leptospira spp. would facilitate a better assessment of the prevalence and epidemiology of leptospirosis, which constitutes a health problem in many countries.

El presente estudio describe el desarrollo y aplicación de un nuevo ensayo de PCR para la detección específica de leptospiras patógenas y su comparación con un protocolo reportado previamente. Se diseñaron nuevos cebadores para la optimización y evaluación de la PCR en tejidos embebidos en parafina infectados artificialmente. La PCR se aplicó además a muestras de tejidos embebidos en parafina y se realizó la secuenciación del amplicón resultante. La PCR diseñada fue más eficiente que el protocolo reportado, permitiendo la amplificación del fragmento de ADN esperado en las muestras infectadas artificialmente y del 44% de las muestras post mortem. Se secuenciaron 10 amplicones provenientes de pacientes diferentes. La aplicabilidad de una herramienta altamente sensible y específica en la búsqueda de leptospiras patógenas en especímenes histopatológicos podría facilitar una mejor valoración de la prevalencia y la epidemiología de la leptospirosis, la que constituye un problema de salud en disímiles países.

Sistemas serológicos rápidos utilizados para la pesquisa de leptospirosis humana en Cuba / Rapid serological diagnosis systems for human leptospirosis screening in Cuba

Introducción: la leptospirosis humana necesita de un diagnóstico microbiológico rápido y oportuno por ser una enfermedad letal y frecuente en todo el mundo. Objetivo: incrementar la calidad del diagnóstico microbiológico de esta infección, ampliar el conocimiento sobre la circulación de serogrupos de leptospiras en Cuba y demostrar la utilidad de un sistema de aglutinación con partículas de látex cubano y los sistemas inmunocromatogénicos comerciales LEPTO Dipstick, Lepto Tek Lateral Flow, Lepto Tek Dri Dot y SD Leptospira IgM-IgG. Métodos: en esta investigación descriptiva se utilizaron sueros de casos controles positivos y negativos para evaluar y medir el valor diagnóstico de los sistemas serológicos rápidos con respecto al método de referencia de microaglutinación (MAT). Todas las técnicas utilizadas en este reporte aparecen descritas en el Manual de Operaciones y Procederes del Laboratorio de Leptospiras, del Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí". Resultados: todos los sistemas estudiados presentaron aceptables valores de sensibilidad, especificidad y concordancia en comparación con el método de referencia internacional de microaglutinación con microrganismos vivos. Se constató la amplia selectividad (reactividad antigénica) y la fiabilidad diagnóstica de los sistemas, se destacan en particular el látex mezclado de producción nacional, el LEPTO Dipstick y el SD Leptospira IgM-IgG. Conclusiones: ninguno de los procedimientos utilizados fue superado en cuanto a su sencillez, rapidez, simplicidad técnica y grado de ejecución al comparárseles con los métodos tradicionales, incluido el de referencia, y todos resultaron útiles en la pesquisa de anticuerpos frente a leptospiras.

Introduction: human leptospirosis requires rapid and early microbiological diagnosis since it is a common lethal disease worldwide. Objectives: to increase the quality of microbiological diagnosis of this infection, to expand the knowledge on the circulation of groups of leptospiras in Cuba and to show the benefits of an agglutination assay using Cuban latex particles and of commercial immunochromatogenic systems LEPTO Dipstick, Lepto Tek Lateral Flow, Lepto Tek Dri Dot and SD Leptospira IgM-IgG. Methods: this descriptive research used sera from positive and negative control cases to evaluate and measure the diagnostic value of rapid serological diagnosis systems with respect to the microagglutination method of reference (MAT). All the techniques used in this report are described in the Manual of Operations and Procedures of the Leptospira Lab in "Pedro Kourí" Institute of Tropical Medicine. Results: all the studied diagnosis systems exhibited acceptable values of sensitivity, specificity and agreement when compared to the international microagglutination method of reference with live microorganisms. The great selectivity (antigen reactivity) and the diagnostic reliability of the diagnostic systems were confirmed; particularly the mixed Cuban-made latex, the LEPTO Dipstick and the SD Leptospira IgM-IgG. Conclusions: the procedures used in this research work exceeded the traditional methods including the microagglutination method of reference in terms of easiness, rapidity, technical simplicity and level of performance, and all were useful for the screening of antibodies to leptospiras.